LA GASTRECTOMIA NELLA SPERIMENTAZIONE

 

In passato la sperimentazione sull’animale ha consentito di verificare prima dell’applicazione clinica la fattibilità di varie tecniche ricostruttive dopo resezione gastrica. Come esempio, ricordo che la ben nota diversione bilio-pancreatica in Y fu dapprima sperimentata nel cane da Wölfler nel 1881 e solo in seguito, nel 1897, Cesar Roux pubblicò una casistica di trentadue gastro-enterostomie, effettuate nell’uomo con questa tecnica (Roux, 1897). Attualmente essa è nota come “gastro-digiunoplastica secondo Roux”. Inoltre, sull’animale sono state sperimentate tecniche per ridurre l’entità di alcune sequele della gastrectomia, come l’esofagite da riflusso, la riduzione del volume di cibo ingerito giornalmente, il calo ponderale e l’iposideremia. Tra i risultati più notevoli ricordiamo la definizione dell’importanza e della lunghezza del tratto antireflusso nella Roux e l’accorgimento proposto da Orr, per migliorare la vascolarizzazione del moncone digiunale anastomizzato all’esofago dopo gastrectomia (Orr, 1947). Molti studi sperimentali sono stati effettuati in passato con lo scopo di trattare e di chiarire la fisiopatologia della sindrome da agastria (Cabrera, 1957; Everson, 1952; Ivy, 1940; Johnson, 1953; Kelly, 1954; Mann, 1932; Rocco, 1951; Shioya, 1958; Steingraber, 1953; Veron, 1913).

Attualmente una sperimentazione che preveda la gastrectomia o la gastroresezione nell’animale potrebbe avere i seguenti obbiettivi:

– valutare preliminarmente la fattibilità di una nuova ricostruzione e confrontarne la funzionalità con una ricostruzione di riferimento, per ottenere dati orientativi sulla sua utilità per l’uomo;

– studiare rimedi farmacologici per l’esofagite da reflusso alcalino;

– studiare la motilità intestinale in un’esofago-digiunoplastica o in una gastro-digiunoplastica;

– valutare l’efficacia di nuovi modelli di suturatrice.

Per decenni l’animale più utilizzato per la sperimentazione in chirurgia gastrica è stato il cane, animale che era di basso costo e con un’anatomia addominale simile a quella umana. Attualmente, per la sperimentazione è preferito il suino, più economico, meno aggressivo e con un’anatomia dell’apparato gastro-intestinale che per la maggior parte delle applicazioni in chirurgia sperimentale dell’apparato digerente presenta differenze poco significative rispetto a quella umana. Il suo utilizzo sperimentale è subordinato a una richiesta scritta del sostenitore del progetto all’“Organismo preposto al benessere degli animali (OPBA)”, istituito presso l’Istituto in cui egli desidera svolgere la ricerca. L’OPBA ha il compito di esprimere una valutazione motivata sui progetti di ricerca, che prevedano l’utilizzo di animali per fini scientifici, tenendo conto della vigente legislazione in materia. Qualora la valutazione sia positiva, l’OPBA trasmette la richiesta di autorizzazione al Ministero della Salute.

Come si legge nel sito ministeriale, “tutti i progetti di ricerca con l’impiego di animali Vertebrati e taluni Invertebrati (Cefalopodi) devono essere autorizzati dal Ministero della Salute.
La domanda di autorizzazione deve essere presentata all’Ufficio VI della DGSAF del Ministero da parte degli “Organismi Preposti al Benessere Animale (OPBA)”.
“Il Ministero della Salute, autorità competente, rilascia apposita autorizzazione dopo una valutazione e acquisito il parere tecnico-scientifico dell’Istituto Superiore di Sanità o di altri enti tecnico-scientifici ovvero del Consiglio Superiore di Sanità in caso di utilizzo di primati non umani, cani, gatti ed esemplari in via di estinzione.”

La richiesta di autorizzazione si articola nei seguenti documenti, scaricabili dal sito ministeriale:

• Richiesta di autorizzazione progetto di ricerca (Articoli 31 e 33)
• Richiesta di autorizzazione progetto di ricerca (Articolo 31)
• 1 – Allegato A – Proposta del progetto
• 2 – Allegato B – Autocertificazione competenza del personale
• 3 – Allegato C – Parere Motivato OPBA
• 4 – Allegato D – Autocertificazione Membro Scientifico
• 5 – Allegato E Autocertificazione Assenza condanne penali
• 6 – Allegato VI – del D.lgs 26/2014
• 7 – Allegato IX – Sintesi Non Tecnica conforme all’Allegato IX del D.lgs 26/2014
• 7 – Allegato IX – Sintesi Non Tecnica conforme all’Allegato IX del D.lgs 26/2014
• Linee guida recanti modalità di presentazione della domanda di autorizzazione per progetto di ricerca 

Per la maggior parte degli interventi nell’ambito dell’apparato digerente su animali di grossa taglia una scelta adeguata è il suino Landrace x White di 40 Kg, che è economico e che può essere utilizzato per valutazioni fino a un mese dopo l’intervento. Se l’esperimento ha durata maggiore, è essenziale utilizzare animali adulti, per evitare eccessive variazioni della massa corporea durante l’esperimento. In questo caso, come alternativa al cane, è opportuno utilizzare la razza suina Minipig, che fornisce adulti di massa corporea più contenuta del suino Landrace.

Gli animali sono stabulati uno per cella almeno una settimana prima dell’intervento, per consentirne l’adattamento al nuovo ambiente e il ripristino del normale comportamento alimentare. Ciascun suino riceve giornalmente il mangime in quantità definite. Due o tre giorni prima dell’intervento si valutano in condizioni basali i parametri che si vogliono studiare nel corso dell’esperimento.

Gli animali sono tenuti senza cibo 24 ore prima dell’intervento, al fine di ottenere una completa pulizia intestinale. La somministrazione di acqua è sospesa 4 ore prima dell’intervento. Il giorno dell’intervento gli animali sono sedati con ketamina 10 mg/Kg e midazolam 5 mg. i.m., quindi pesati, posti sotto monitoraggio elettrocardiografico ed intubati tramite tracheotomia tra il II ed il III anello tracheale. La tracheotomia evita le difficoltà dell’intubazione per via orale, che richiede esperienza specifica e laringoscopio con lama molto lunga.

L’anestesia è condotta con O₂/NO₂ nel rapporto 3/7.

L’intervento è condotto in sterilità. In caso contrario, nonostante l’elevata resistenza alla sepsi, in questi animali è comune la formazione di ascessi cronici, che incidono negativamente sulla curva ponderale. E’ raccomandabile dunque il rispetto delle norme igieniche conosciute per gli interventi chirurgici sull’uomo. Se nel corso della seduta operatoria si rende necessaria la sterilizzazione di materiale e non vi è disponibilità immediata di una sterilizzatrice, un’adeguata disinfezione è ottenuta con un’immersione del materiale in formaldeide per alcuni minuti, seguita da lavaggio con acqua sterile. L’immersione in formaldeide per alcune ore è sufficiente anche per la sterilizzazione di materiale monouso di costo elevato, come il catetere venoso centrale, che può perciò essere ripetutamente utilizzato.

Il primo atto chirurgico è l’inserimento di un catetere venoso centrale per l’infusione di liquidi durante l’intervento e nel postoperatorio. Effettuata un’incisione subito cranialmente allo sterno e lungo il bordo posteriore del muscolo brachiocefalico destro, la vena giugulare interna è isolata e legata. Attraverso una corta incisione cutanea il catetere venoso centrale è tunnelizzato nel sottocute fino alla vena giugulare, in cui è introdotto caudalmente alla legatura. Una seconda legatura stringe la vena attorno al catetere; infine il catetere è fissato alla cute con un paio di punti.

L’accesso preferibile per la gastrectomia è la laparotomia mediana. Un divaricatore tipo Balfour espone adeguatamente il campo operatorio. La strumentazione utile per l’intervento è riportata in tab. 14.3.

Sul piano anatomico durante un intervento di gastroresezione o di gastrectomia nel suino appaiono le seguenti differenze rispetto all’uomo:

– assenza dell’accollamento colo-epiploico;

– milza mobile per assenza del legamento spleno-renale, spleno-colico e spleno-diaframmatico;

– notevole ampiezza del legamento gastro-splenico;

– assenza dell’adesione posteriore del duodeno alla fascia di Treitz;

– sbocco del coledoco circa due centimetri distalmente allo sfintere pilorico;

– accollamento della prima ansa digiunale e del suo meso al colon trasverso;

– mesocolon trasverso poco ampio;

– meso della prima ansa digiunale poco ampio;

– arcate vascolari del digiuno molto corte, da cui si dipartono lunghi rami terminali;

– notevole sottigliezza della parete digiunale;

– notevole sviluppo della tonaca muscolare dell’esofago e mucosa esofagea dotata di elevata resistenza alla trazione;

– scarso adipe intraddominale.

Prima di iniziare un esperimento, è opportuno sacrificare un animale, per eseguire tutti i rilievi utili a comprendere adeguatamente i dettagli anatomici e tecnici.

Effettuato l’intervento, gli animali sono tenuti a digiuno per cinque giorni, somministrando giornalmente tramite la via centrale 500 ml una nutrizione parenterale di semplice composizione, per esempio una soluzione al 8 – 10% di aminoacidi con 60 mEq di potassio, 30 mEq di sodio, 10 mEq di magnesio, 60 mEq di fosfato e 500 ml di soluzione di glucosio al 20%. Metà di questi liquidi sono infusi al mattino e metà nel tardo pomeriggio con velocità d’infusione non superiore a 15 ml/min. Al termine di ogni infusione è essenziale riempire la via centrale con soluzione eparinata per evitarne l’occlusione. Se la via si occlude, possono essere risolutivi ripetuti lavaggi con soluzione eparinata o sondaggi con la guida flessibile sterile del catetere venoso centrale. In caso contrario l’iniezione frazionata di soluzione fisiologica nel sottocute in sedazione è un rimedio temporaneo per idratare l’animale. Se l’idratazione deve essere continuata per oltre due giorni è preferibile posizionare in sedazione un nuovo catetere controlateralmente.

La profilassi antibiotica è attuata con 1 grammo/die di cefotaxime ev o con altro antibiotico ad ampio spettro fino alla rimozione del catetere venoso.

In quarta giornata è controllata la peristalsi, invariabilmente presente in assenza di complicanze. Se la ricanalizzazione intestinale in quarta giornata è ancora torpida, è utile somministrare in sedazione un Clisma Fleet intra-rettale; un ritardo di canalizzazione può infatti interferire con l’ingestione di cibo e dunque con i risultati dello studio.

In sesta giornata postoperatoria è consentito l’accesso all’acqua e a 500 grammi di mangime somministrati in frazioni. Dalla settima giornata la disponibilità giornaliera di mangime è aumentabile a 4000 grammi. Particolarmente importante è il collocamento di una mangiatoia fissa con bordi piuttosto alti, per evitare la dispersione del mangime sul pavimento, che impedisce una corretta valutazione dei quantitativi consumati.

Quando l’animale ha raggiunto la completa autonomia alimentare, si rimuove il catetere venoso centrale.

Ogni studio si caratterizza per la registrazione di determinati parametri. Per esempio, se lo scopo dello studio è di esaminare la funzionalità di un’esofago-digiunoplastica, gli animali sono pesati settimanalmente ed è valutato due volte alla settimana il quantitativo di cibo consumato nel singolo pasto dopo 5 ore di digiuno, il quantitativo di cibo consumato nelle 24 ore e periodicamente il quantitativo di cibo consumato nel singolo pasto dopo 24 ore di digiuno. E’ altresì importante valutare la durata dei pasti. La diversa durata e continuità dei pasti nei vari animali inficia parzialmente l’attendibilità dei risultati fornita da uno studio condotto su un piccolo numero di suini. Periodicamente sono valutati emocromo, calcemia e sideremia. Indagini speciali sono il dosaggio dei lipidi fecali, il calcolo del malassorbimento lipidico e la valutazione della densità minerale ossea.

Il giorno del sacrificio l’animale è anestetizzato e sono ripetuti i prelievi ematici per dosaggi emato-chimici, se contemplati nello studio. Se è utile conoscere la capacità della ricostruzione, il cavo addominale è esposto tramite laparotomia, è instillata acqua nella ricostruzione dopo averla clampata agli estremi che la definiscono e ne è misurato il volume; si prelevano infine i campioni più opportuni per la valutazione istologica.

 

In alcuni casi la procedura sperimentale trova più conveniente applicazione nel ratto (Helsingen, 1961; Lin, 2006; Meli, 1957; Nabet, 1958; Pietri, 1957; Salvaneschi, 1957; Swendseid, 1957). Indicazioni possono essere lo studio della mielopatia da deficit di vitamina B12 dopo gastrectomia, degli effetti lesivi sull’esofago del reflusso bilio-pancreatico dopo resezione gastrica o dopo gastrectomia, di specifici nutrienti sull’immunomodulazione.

Si utilizzano ratti Sprague Dawley di 400-450 g. Gli animali sono stabulati in gabbie metaboliche almeno cinque giorni prima dell’intervento, per registrare le quantità di acqua ingerita e le diuresi giornaliere. Gli animali sono messi a digiuno almeno 12 ore prima dell’intervento.

L’induzione è attuata con etere: si pone il ratto in un recipiente trasparente a chiusura in cui sono stati fatti evaporare 10 ml di etere. Dopo alcuni minuti si estrae l’animale e si prosegue l’anestesia con lo stesso anestetico. Un mezzo semplice per somministrare l’anestetico è una siringa da 60 ml privata dello stantuffo e colmata di garze in cotone. L’estremità conica è otturata e le garze sono bagnate con alcuni ml di etere. L’estremità aperta della siringa è collocata davanti alle narici dell’animale. L’etere aumenta la secrezione delle vie respiratorie, ma se l’animale è sano, l’intervento può essere condotto senza che questo effetto collaterale abbia rilevanza. In caso di depressione respiratoria il tubo anestetico sarà allontanato dal muso dell’animale per alcuni minuti. In caso di arresto cardio-circolatorio l’allontanamento dell’anestetico, il massaggio cardiaco, attuato con la pressione alternata di un dito al centro del torace, e la ventilazione, attuata soffiando in una siringa da 10 ml collocata con il cono nella bocca dell’animale, sono il più delle volte sufficienti a ristabilire la circolazione e il respiro.

Dopo l’anestesia l’animale è posto su una tavoletta in legno o su altro supporto isolante, per limitare le perdite di calore durante l’intervento. La cute addominale è depilata con rasoio e le zampe divaricate e fissate alla tavoletta con nastro adesivo. L’incisione è mediana xifo-pubica. Retrattori modellati con il filo metallico di graffette e fissati alla tavoletta con cerotto ad elevata adesività sono un mezzo semplice per operare senza necessità di aiuto.

La resezione gastrica e la ricostruzione sono procedure assai semplici. La strumentazione deve essere pulita, ma non necessariamente sterile. Il set di base è formato da un bisturi, un porta-aghi tipo Barraquer, una pinzetta oculistica, una forbice delicata per dissezione e alcune pinze Mosquito curve. Un’ottica per ingrandire la visuale è utile, ma non necessaria. Per le legature vascolari maggiori è sufficiente un filo in seta 6/0; i vasi minori sono coagulati. Le anastomosi sono confezionate con filo 7/0. I piani fasciali e muscolari sono chiusi in unico strato in continua con catgut 3/0 o 4/0. La cute è suturata con catgut 4/0. Al risveglio ciascun animale è stabulato in una gabbia metabolica. Nei successivi tre giorni si somministrano liquidi sottocute in rapporto alle quantità di acqua ingerita quotidianamente prima dell’intervento e alla diuresi attuale. Successivamente gli animali sono collocati in gabbie normali e periodicamente si registra il peso corporeo. Le quantità di cibo e di acqua ingerite oltre agli altri parametri allo studio sono valutati in gabbia metabolica.

Al termine dell’esperimento il sacrificio è attuato in ambiente saturo di etere e sono prelevati i tessuti che si desidera esaminare.

Bibliografia

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Riferimenti normativi

D.L. 27 gennaio 1992, n° 116 “Attuazione della direttiva n. 86/609 CEE in materia di protezione degli animali utilizzati a fini sperimentali o ad altri fini scientifici”.

D.L. 6 agosto 2013 n. 96 “Delega al Governo per il recepimento delle direttive europee e l’attuazione di altri atti dell’Unione Europea”; art. 13: ”Criteri di delega al Governo per il recepimento della direttiva 2010/63/UE del Parlamento europeo e del Consiglio, del 22 settembre 2010, sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici”.